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本试剂盒采用BSA作为蛋白质标准品溶液。本试剂盒最小检测蛋白量可达0.2μg，检测浓度下限达到10μg/mL。本试剂盒测定范围为20～2000μg/mL，在此范围内有较好的线性。如需检测10μg/mL-200μg/mL的低浓度蛋白样品，可以选用微量BCA蛋白定量试剂盒。如需检测BCA法背景值较高而不适合BCA法的样品，可以选用Bradford蛋白定量试剂盒。

在碱性条件下，蛋白质将Cu²⁺还原为Cu⁺，Cu⁺与BCA试剂形成紫颜色的络合物，该复合物为水溶性，其在562nm处有强吸光性，在一定浓度范围内，吸光度与蛋白质含量呈良好的线性关系。通过测定562nm的吸光值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。


BCA法快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞蛋白提取过程中，常用浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂(DTT，巯基乙醇)和脂类的影响。

组分	250T	500T	1000T
组分A：BCA试剂A	50mL	100mL	2×100mL
组分B：BCA试剂B	1mL	2×1mL	4×1mL
组分C：蛋白标准(5mg/mL)	1mL	1mL	1mL

保存：BCA试剂室温密闭保存，蛋白标准-20℃保存，有效期1年。

• 蛋白标准品注意防止微生物污染，避免反复冻融。
  
• 可以根据需要将蛋白标准分装后冻存。

分光光度计、酶标仪、移液器、纯水、生理盐水、96孔板

• 在低温条件或长期保存导致BCA试剂出现沉淀时，可搅拌或37℃温育使溶解，如发现细菌污染则应丢弃。
  
• 因为BCA测定时颜色会随着时间的延长不断加深，且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则如需精确测定，每次测定都需重做标准曲线。若需得到更为精确的蛋白浓度结果，每个蛋白梯度和样品均需做复孔。
  
• 若测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加吸光度或颜色没有明显变化，原因可能是样品中含有严重干扰BCA法测定蛋白浓度的物质。BCA蛋白浓度测定试剂盒对样品中各种物质详细的兼容性，参见附件BCA蛋白浓度测定兼容性表。
  
• 试剂A与试剂B用应密闭保存。
  
• 当试剂A和B混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失。
  
• 使用温箱孵育时，应注意防止因水份蒸发影响检测结果。
  
• 蛋白标准液的加量应当准确，如果加量不准确，会导致制作出来的标准曲线出现偏差，影响待测样品的浓度计算，应使用精确度高的移液器。
  
• 实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可能不适合BCA法测定，可改用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。
  
• 以下步骤按使用96孔板和酶标仪检测为例，也可以使用普通的分光光度计测定，但测定时，需根据比色皿的最小检测体积，适当加大BCA工作液的用量使不小于最小检测体积，样品和标品的用量应按比例放大。使用分光光度计测定蛋白浓度时，每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少。
  
• 比色皿法检测需较大量(100μL)的蛋白样品，但其在检测中使用蛋白样品与BCA工作液的比率为1:20(v/v)，从而降低干扰物质带来的影响。微孔板法检测操作简单方便，仅需少量(10～25μL)的蛋白样品，但其在检测中使用蛋白样品与BCA工作液的比率为1:10(v/v)，某种程度上限制干扰物质的承受浓度以及降低最低检测水平。由于酶标板的光径比比色皿短，使得酶标板检测需要更高的样品：BCA工作比率来过得相同的检测灵敏度。请根据实际需要选择方法。

一、试剂配制：

• BCA工作液配制：
  根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。
  例如5mL BCA试剂A加100μL BCA试剂盒B，混匀，配制成5.1mL BCA工作液。
  总BCA工作液体积=(标准品+待测样品)×每个样品所需要的BCA工作液×重复数
  注：
  ● 微孔板检测每个样品加200μL BCA工作液，比色皿检测时每个样品加1.0mL或2.0mL BCA工作液。
  ● 重复数根据需要设定，一般做2～5个复孔，也可以只做一个。
  ● BCA试剂B加入BCA试剂A中后，迅速浑浊，通过混匀后立即变澄清。BCA工作液装入密封容器内，室温条件24h稳定。
  ● 由于加样可能存在误差，建议试剂配制BCA工作液时，多配制1～2个孔工作液量。
  ● 工作液体积计算举例：BSA标准品样本个数为8个，未知样本个数2个，复孔数3个。
  微孔板检测法：
  BCA工作液总量=(8个BSA标准品样本+2个未知样本)×3个复孔×200μL/每个样本工作液体积=6mL
  比色皿检测法：
  BCA工作液总量=(8个BSA标准品样本+2个未知样本)×3个复孔×2mL/每个样本工作液体积=60mL
  
• 蛋白标准工作液配制：
  根据样品数量配制相应体积的蛋白标准工作液。将蛋白标准储存液用纯水5倍稀释，配成1mg/mL的工作液。
  注：BSA标准品的稀释液最好与待测样品的稀释液一致。如果不方便使用的话，可用0.9%生理盐水或1×PBS或纯水稀释。

二、蛋白检测：

• 96孔微孔板测定：
  
  • 标准曲线绘制。
    取一块酶标板，按以下表格数据加入试剂：
    

    孔号	0	1	2	3	4	5	6	7
    蛋白标准工作液(μl)	0	1	2	4	8	12	16	20
    生理盐水/PBS(μl)	20	19	18	16	12	8	4	0
    对应的蛋白含量(μg)	0	1	2	4	8	12	16	20
    相当于标准品浓度(mg/mL)	0	0.05	0.1	0.2	0.4	0.6	0.8	1

    
    注：
    ● 此操作方法采用简便快速的步骤，对加样得到准确性要求较高，一定要注意实验操作规范，提高上样量的精确度。
    ● 也可以采用倍比稀释流程配制蛋白标准品。
    ● 每次测定蛋白前都需重做标准曲线。
    ● BSA标准品的稀释液最好与待测样品的稀释液一致。如果不方便使用的话，可用0.9%生理盐水或1×PBS或纯水稀释。
    
  • 按上表数据在做好标记的96孔板微孔中稀释好蛋白标准品并充分混匀。
    
  • 样品检测。分别在做好标记的其他待测孔加好20μL待测蛋白样品(原液或稀释液)。
    注：
    ● 推荐每个待测定的样本做2～3个平行反应。
    ● 根据已知大概蛋白浓度范围或预实验数据，将待测蛋白样品稀释至适当浓度。
    
  • 在标准曲线孔和待测样品孔分别每孔加入200μL BCA工作液。充分混匀。
    
  • 盖上96孔板盖，37℃放置30分钟。
    注：如果蛋白浓度较低时，可以室温放置2小时或者60℃放置30分钟，颜色会随着时间的延长不断加深，显色反应也会随着温度升高而加快。
    
  • 在5分钟内完成酶标仪检测。
    
  • 用酶标仪测定A562，以不含BSA的光吸收值(0号孔)为空白对照。
    
  • 以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。
    注：由于操作误差导致标准品读数严重偏离线性曲线的应舍去。
    
  • 根据测得的吸收值，在标准曲线上即可查得待测样品的蛋白含量。
    注：
    ● 待测未知样品浓度可以从标准曲线方程中计算得出，实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。
    ● 如果得到的蛋白浓度不在检测范围内，重新稀释样品后再次测定。
    
  • 计算蛋白浓度：
    以查得的蛋白含量除以样品体积20μL，再乘以样品检测前相应的稀释倍数即可得到待测样品的实际浓度。
• 比色皿测定：
  
  • 标准曲线绘制。
    在比色皿/试管中，按以下表格数据加入试剂：
    

    孔号	0	1	2	3	4	5	6	7
    蛋白标准工作液(μl)	0	5	10	20	40	60	80	100
    生理盐水/PBS(μl)	100	95	90	80	60	40	20	0
    对应的蛋白含量(μg)	0	5	10	20	40	60	80	100
    相当于标准品浓度(mg/mL)	0	0.05	0.1	0.2	0.4	0.6	0.8	1

    
    注：
    ● 此操作方法采用简便快速的步骤，对加样得到准确性要求较高，一定要注意实验操作规范，提高上样量的精确度。
    ● 也可以采用倍比稀释流程配制蛋白标准品。
    ● 每次测定蛋白前都需重做标准曲线。
    ● BSA标准品的稀释液最好与待测样品的稀释液一致。如果不方便使用的话，可用0.9%生理盐水或1×PBS或纯水稀释。
    
  • 按上表数据在做好标记的比色皿中稀释好蛋白标准品并充分混匀。
    
  • 样品检测。分别在做好标记的其他待测比色皿中加好100μL待测蛋白样品(原液或稀释液)。
    注：
    ● 推荐每个待测定的样本做2～3个平行反应。
    ● 根据已知大概蛋白浓度范围或预实验数据，将待测蛋白样品稀释至适当浓度。
    
  • 在标准曲线孔和待测样品孔分别每孔加入2mL BCA工作液。充分混匀。
    
  • 37℃放置30分钟。
    
  • 在5分钟内完成分光光度计检测。
    
  • 以不含BSA的光吸收值(0号孔)为空白对照，用分光光度计测定A562。
    
  • 以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。
    注：由于操作误差导致标准品读数严重偏离线性曲线的应舍去。
    
  • 根据测得的吸收值，在标准曲线上即可查得待测样品的蛋白含量。
    注：
    ● 待测未知样品浓度可以从标准曲线方程中计算得出，实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。
    ● 如果得到的蛋白浓度不在检测范围内，重新稀释样品后再次测定。
    
  • 计算蛋白浓度：
    以查得的蛋白含量除以样品体积100μL，再乘以样品检测前相应的稀释倍数即可得到待测样品的实际浓度。

• 是否每次测定时都需要做标准曲线？
  建议每次测定时都做标准曲线。因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则如需精确测定宜每次都做标准曲线。
  
• 测定时发现随着浓度的增加吸光度或颜色没有明显变化。
  可能的原因是样品中含有严重干扰BCA法测定蛋白浓度的物质，请参考详细的BCA法的兼容性列表。
  
• 待测样品一定需要稀释吗？
  不一定。对于样本来说，需不需要稀释取决于样本的检测值是否落在标准曲线范围内，如果样本浓度超过试剂盒的最高的检测限，那么样本是需要稀释后检测的。

不干扰BCA法测定的物质浓度限值：

成分	相容浓度		成分	相容浓度
NP-40	5.0%		葡萄糖	10mM
Emulgen	1.0%		EDTA	10mM
Hepes	100mM		Sodium Chloride	1.0M
DTT	1mM		NaOH	0.1M
Guanidine·HCl	4.0M		Ammonium Sulfate	1.5M
Triton X-100	5.0%		乙酸钠pH5.5	200mM
辛基糖苷	5.0%		SDS	5.0%
Urea	3.0M		Bri j-35	5.0%
蔗糖	40%		Lubrol	1.0%
Glycine，pH2.8	100mM		CHAPS	5.0%

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